Irányított Fehérje-evolúció Kutatócsoport

Leader of the group

Gábor Pál associate professor

Members of the group

Andrea Kocsis PhD student

Péter Rapali

Katalin Zboray undergraduate

Activity

Research areas

Kombinatorikus mutagenezis eljárások

A fág-bemutatás sémája

Kombinatorikus mutagenezis eljárások

A fehérje-fehérje kölcsönhatások során rendszerint több száz atom vesz részt másodlagos kölcsönhatásokban. A folyamatban nagy felületek temetődnek el, a fehérjék térszerkezete módosulhat. A folyamat összetettsége miatt jelenleg nincs olyan számítási módszer, amivel két kölcsönható fehérje, illetve ezek komplexének szerkezete ismeretében kielégítő pontossággal meg lehetne jósolni, milyen erős a kialakult kölcsönhatás. Az sem jósolható kellő pontossággal, hogy a stabilitáshoz az egyes atomcsoportok (például oldalláncok) milyen mértékben járulnak hozzá. Emiatt az egyes mutációk hatása sem jósolható, tehát nem tudunk hatékonyan újfajta, valamilyen elvárásoknak megfelelő fehérje változatokat tervezni. A fenti problémák megoldása hatalmas mennyiségű, új fehérje mutánsok kölcsönhatásaira vonatkozó mérési adatot igényel. Ezek olyan szekvencia-aktivitás adatsereget szolgáltatnak, amely elengedhetetlen kiindulópontja a kölcsönhatási energiát számító algoritmusok továbbfejlesztésének. A mutánsok hatalmas tömegű egyedi előállítása rendkívül költséges, és bizonyos számú variáns felett praktikusan nem finanszírozható. Egy ötletes kerülőúttal mindez megoldható oly módon, hogy nem egyenként állítunk elő mutánsokat, hanem kombinatorikus mutagenezis eljárásokkal készítünk hatalmas, többmilliárd tagszámú mutáns könyvtárakat. A mutánsok génjét monoklonális módon bakteriofágon fejezzük ki, ahol is a mutáns génje fizikailag össze van kapcsolva a kódolt fehérjével. Az ábrán látható módon egy irányított evolúciós eljárással szelektáljuk azokat a variánsokat, amelyek egy számunkra fontos funkcióval, általában egy adott molekulához való kötőképességgel rendelkeznek. Az így elkülönített alkönyvtárból statisztikailag elegendő számú klón DNS-alapú szekvenálásával kideríthető, hogy az adott kötőtulajdonság ellátásához milyen fehérje szekvencia szükséges. Emellett a módszerrel olyan hasznos, a természetben nem létező fehérje formákat hozunk létre, amelyek praktikus szempontból kiemelkedő jelentőségűek lehetnek, például gátolhatnak olyan enzimeket, amelyek ellen korábban nem rendelkeztünk inhibitorral. Laboratóriumunkban sikeresen alkalmazzuk ezt a megközelítést fehérjék szerkezet-funkció kapcsolatainak megértésére és új, hasznos variánsok létrehozására. A technológia segítségével tavaly bizonyítottuk, hogy a reverzibilis szerin proteázokra vonatkozó, több évtizede érvényesnek hitt szabályrendszer, a „Laskowski modell” nem általános érvényű. Sikereket értünk el egymással közeli rokon enzimek eltérő tulajdonságainak feltérképezésében, és az említett megközelítéssel sikerült inhibitorokat fejlesztenünk humán komplement proteázok ellen is. A módszer arra is alkalmas, hogy feltárjuk egyes peptidkötő fehérjék optimális kötőpartnerének szekvenciáját, ami segíthet a valós kötőpartnerek azonosításában. Mindezek mellett a labor tRNS-ek és aminoacil tRNS szintetázok kapcsolatának bioinformatikai és kísérletes vizsgálatában is érdekelt.

Collaborations

Home side

Gráf László
(ELTE, Biokémiai Tanszék)

Nyitray László
(ELTE, Biokémiai Tanszék)

Gáspári Zoltán
(ELTE, Kémiai Intézet)

Perczel András
(ELTE, Kémiai Intézet)

Jakó Éena
(eScience Regionális Egyetemi Tudásközpont)

Gál Péter
(MTA SZBK Enzimológiai Intézet)

Závodszky Péter
(MTA SZBK Enzimológiai Intézet)

International

Sachdev Sidhu
(University of Toronto, Canada)

Antony Kossiakoff
(University of Chicago, USA)

Wuyuan Lu
(University of Maryland, USA)

Catherine Florentz
(Louis Pasteur University, Strasbourg, France)

Supporters

OTKA

eScience RET

Selected publications

  • Jako, E., Ittzes, P., Szenes, Á., Kun, A., Szathmary, E. & Pál, G.
    In silico detection of tRNA sequence features characteristic to aminoacyl-tRNA synthetase class membership. (2007)
    Nucleic Acids Res 35, 5593-609.
  • Pál, G., Kouadio, J. L., Artis, D. R., Kossiakoff, A. A. & Sidhu, S. S.
    Comprehensive and quantitative mapping of energy landscapes for protein-protein interactions by rapid combinatorial scanning. (2006)
    J Biol Chem 281, 22378-85.
  • Pál, G., Ultsch, M. H., Clark, K. P., Currell, B., Kossiakoff, A. A. & Sidhu, S. S.
    Intramolecular cooperativity in a protein binding site assessed by combinatorial shotgun scanning mutagenesis. (2005)
    J Mol Biol 347, 489-94.
  • Pál, G., Bernat, B., Sun, M. & Kossiakoff, A. A.
    Determination of the energetics governing the regulatory step in growth hormone-induced receptor homodimerization. (2003)
    Proc Natl Acad Sci U S A 100, 952-7.