A humán tripszin 4 nyomában

Leader of the group

László Szilágyi emeritus associate professor

Members of the group

Activity

Research areas

A humán tripszinogén 4: különleges szerkezet, ismeretlen funkció

A tripszin diszulfid hídjainak szerepének tanulmányozása vezetett ahhoz, hogy mintegy tizenkét évvel ezelőtt humán pankreatikus könyvtárból klónoztuk a humán tripszineket. Rendkívül érdekes ugyanis, hogy míg a gerincesek tripszinjei 12 ciszteint (6 diszulfid hidat) tartalmaznak, a humán tripszin 1 csak 5, a humán tripszin 2 csak 4 diszulfid híddal rendelkezik. A klónozás során kaptunk egy harmadik tripszin formát is, amely azonosnak bizonyult a néhány évvel azelőtt humán agyból klónozott tripszinogén 4 proteáz doménjével. A tripszin 4 proteolitikus doménjét expresszáltuk és meghatároztuk enzimatikus tulajdonságait. Az enzim teljesen aktív szintetikus kromogén vagy fluorogén szubsztrátokon, ugyanakkor nem aktiválja a zimogéneket és egyéb fehérje szubsztrátokon is korlátozott aktivitást mutat. Nem gátolható kanonikus proteáz inhibitorokkal sem. Irányított mutagenezis segítségével kimutattuk, hogy ezért egyetlen pontmutáció felelős, melynek következtében a tripszinszerű szerin proteázokban általánosan konzervált Gly193 (GGC) helyett arginin (CGC) épül be a fehérjébe. A 193-as pozíció kiemelt jelentőségű a katalízis szempontjából, amido hidrogénje ugyanis része az ún. oxianion üregnek, mely hidrogén hidakkal stabilizálja a katalízis során kialakuló tetraéderes oxianion köztes terméket. A tripszin 4 általunk meghatározott 3D szerkezete magyarázatott adott az enzim tulajdonságaira; a peptidgerinc lefutása a 193-195 tartományban, vagyis az oxianion üreg geometriája nem változik a mutáció hatására, az arginin oldallánc azonban betölti az S2’ szubsztrátkötő zsebet és így megakadályozza a fehérje természetű szubsztrátok és inhibitorok kötődését. Genomszekvenálási eredményekből kiderült, hogy a humán tripszinogén 4 kromoszomális lokalizációja különbözik a többi tripszinétől, míg azok a 7. kromoszómán találhatók, a tripszin 4 a 9. kromoszómára transzlokálódott. Ezen a helyen két transzkriptum képződésére van lehetőség, melyek az első exonban különböznek. A pankreászban szabályos tripszinszerű szignál peptiddel az ún. mezotripszinogén expresszálódik, míg az agyban és számos más szövetben az első exonként egy eddig ismeretlen, de szignál szekvenciaként nem funkcionáló peptidszakasz épül be a fehérjébe, ezt a formát nevezzük tripszinogén 4-nek. Ez a génátrendeződés rendkívül új keletű, csak az emberben és az emberszabású majmokban található meg. A gén analízise alapján két transzlációs iniciációs helyet feltételeztek, egy 72 tagú proszekvenciával rendelkező forma egy ATG iniciációs kodon, míg egy 28 tagú proszekvenciával rendelkező forma egy - egyébként leucint kódoló - CTG iniciációs kodon felhasználásával keletkezhet. Vizsgálataink során humán agymintákból mRNS-t és fehérjét is izoláltunk. A mRNS preparátumokban 5’ RACE alapján nem találtunk olyan formát, amely a távolabbi ATG iniciációs kodont tartalmazta volna, de a transzkriptumok tartalmazták a feltételezett CTG iniciációs kodont. Az izolált fehérje a 28 tagú proszekvenciát tartalmazó formának felelt meg, viszont amino terminálisa a várt metionin helyett leucin volt. A kérdés tisztázására eukarióta expressziós vektorokat terveztünk, melyekkel HeLa sejtekben fehérjét termeltettünk. Amennyiben a vektor tartalmazta mindkét feltételezett iniciációs kodont, mind a 72, mind a 28 tagú proszekvenciával rendelkező fehérje termelődött, és az immun-precipitációval izolált minta szekvenálásakor két amino terminálist kaptunk, nagyobb mennyiségben metionint, kisebb mennyiségben leucint. Ha a távolabbi ATG-t mutációval megszüntettük csak a 28 tagú proszekvenciával rendelkező forma termelődött, és amino terminálisa leucin volt. Ezek az eredmények egyértelműen bizonyítják, hogy ebben a rendszerben a fehérjeszintetizáló apparátus képes a CTG tripletet iniciátor kodonként elfogadni és ekkor a konvencionális metionin helyett leucint épít be a fehérje amino terminálisára. A humán tripszinogén 4 funkcióját illetőleg több hipotézis is napvilágot látott. Feltételezik, hogy szelektív PAR aktivátorként működhet, bár eddig nem sikerült kimutatni, hogy szekretálódna. Előzetes kísérleteinkben humán agykivonathoz aktív tripszin 4-et adva összehasonlító 2D elektrofozézissel a tubulin  alegység és több citoszkeletális reguláló fehérje gyors lebomlását figyeltük meg. Ezek az eredmények összefüggésben lehetnek azokkal a megfigyelésekkel, melyek szerint a tumoros sejtek migráció képessége és a tripszinogén 4 expressziója között korreláció van.

Collaborations

Home side

Gráf László
(ELTE Biokémiai Tanszék)

Schlett Katalin
(ELTE Élettani és Neurobiológiai Tanszék)

International

Supporters

Selected publications

  • Németh, A. L., Medveczky, P., Tóth, J., Siklódi, E., Schlett, K., Patthy, A., Palkovits, M., Ovádi, J., Tőkési, N., Németh, P., Szilágyi, L. & Gráf, L.
    Unconventional translation initiation of human trypsinogen 4 at a CUG codon with an N-terminal leucine. A possible means to regulate gene expression. (2007)
    Febs J 274, 1610-20
  • Kénesi, E., Katona, G. & Szilágyi, L.
    Structural and evolutionary consequences of unpaired cysteines in trypsinogen. (2003)
    Biochem Biophys Res Commun 309, 749-54.
  • Katona, G., Berglund, G. I., Hajdu, J., Gráf, L. & Szilágyi, L.
    Crystal structure reveals basis for the inhibitor resistance of human brain trypsin. (2002)
    J Mol Biol 315, 1209-18.
  • Szilágyi, L., Kénesi, E., Katona, G., Kaslik, G., Juhász, G. & Gráf, L.
    Comparative in vitro studies on native and recombinant human cationic trypsins. (2001)
    J Biol Chem 276, 24574-80.